РеД-Димер-тест

 

Набор реагентов для экспресс метода качественного определения Д-Димеров в цельной крови.

РеД-Димер тест является быстрым качественным тестом определения продуктов деградации поперечносшитого фибрина (Д-димера), в цельной крови человека. Конечный этап свертывания крови – это превращение растворимого фибриногена под действием тромбина в нерастворимый фибрин. В начале процесса происходит полимеризация мономеров фибрина, затем - поперечная сшивка фибрина фактором XIIIа с формированием нерастворимого фибринового сгустка. При этом запускается образование плазмина - основного фермента, лизирующего сгусток. Фибриноген и фибрин расщепляются плазмином до образования продуктов деградации. Только продукты деградации поперечносшитого фибрина (XL-ПДФ) содержат Д-димер, являющиеся специфическими маркерами фибринолиза.

Повышенное содержание Д-димера указывает на реактивный фибринолиз и выявлено в ряде клинических состояний, включая тромбоз глубоких вен, легочную эмболию, ДВС и другие поражения свертывания крови. Определение содержания Д-димера также применяется в качестве прогностического фактора острого инфаркта миокарда; оценка содержания Д-димера используется для контроля тромболитической терапии стрептокиназой и тканевым активатором плазминогена. Повышенное содержание Д-димера как индикатор реактивного фибринолиза является значимым при хирургии, травме, серповидноклеточной болезни, поражении печени, тяжелой инфекции/сепсисе, воспалении и злокачественных заболеваниях.

Метод может быть использован для определения Д-Димера у любых больных.

Принцип метода

РеД-Димер тест основан на технологии SimpliRED® и является методом определения агглютинации аутологичных эритроцитов. Активным веществом является химический конъюгат моноклонального антитела, специфичного для Д-димера, и моноклонального антитела, которое связывается с поверхностью эритроцитов. XL-ПДФ, присутствующие в пробе крови, связываются с конъюгатом на эритроцитах, вызывая перекрестное связывание между конъюгатными группами клеток, что приводит к видимой агглютинации. В отсутствие Д-димера конъюгаты, прикрепленные к эритроцитам, агглютинации не вызывают.

Состав набора, код Д-1

Набор рассчитан на 40 определений.

Тестовый реагент (красная крышка): 1,0 мл раствора, содержащего конъюгат антител к эритроцитам и к XL-ПДФ, стабилизаторы и консерванты - 1 флакон.

Положительный контроль (желтая крышка) - 0,6 мл раствора, содержащего очищенный фрагмент Д-димера человека, стабилизаторы и консерванты - 1 флакон.

Отрицательный контроль (черная крышка) - 1,0 мл 0,9% физиологического раствора, с консервантами - 1 флакон.

Агглютинационные пластины – 40 штук.

Палочки для перемешивания – 40 штук.

Дополнительное оборудование и материалы

Секундомер (таймер).

Пипетки для объема 10 мкл.

Одноразовые перчатки.

Приготовление реагентов

Реагенты не требуют подготовки и готовы к использованию после выдерживания при комнатной температуре в течение, по меньшей мере, 10 минут.

Этикетки и крышки флаконов маркируются по цвету для обеспечения идентификации:

Тестовый реагент - красная крышка;

Положительный контроль - желтая крышка;

Отрицательный контроль - черная крышка.

Хранение и стабильность

Реагенты хранятся при 2-8°С. Не замораживать.

Не использовать реагенты после истечения срока годности, указанного на упаковке

В набор включен Положительный Контроль. Неспособность этого контроля вызвать агглютинацию является показателем потери активности реагентов набора.

Подготовка проб для анализа

Метод РеД-Димер предназначен для работы со свежей капиллярной или венозной цельной кровью.

Венозная кровь берется на антикоагулянтах цитрат натрия, гепарин или ЭДТА. Кровь с антикоагулянтом должна быть исследована в течение 4 часов после забора в условиях хранения при комнатной температуре или может храниться в замороженном состоянии в течение 24 часов до тес-

тирования. Кровь без антикоагулянта должна исследоваться сразу после взятия. Образцы с тенденцией к свертыванию не годятся для анализа.

Проведение анализа

1.  Перед применением выдержать реагенты при комнатной температуре не менее 10 минут и перемешать, покачивая флакон, не допуская вспенивания.

2.  Аккуратно перемешать исследуемую пробу цельной крови, не допуская осаждения клеток.

3.  Внести пипеткой по 10 мкл цельной крови в каждую из реакционных ячеек, помеченных как «-» (ячейка Отрицательного контроля) и

 «ТEST» (Тест-ячейка), на агглютинационной пластине. Использовать новый наконечник для каждой пробы.

4.  Добавить одну каплю Отрицательного Контроля (черный колпачок) в ячейку Отрицательного Контроля.

5.  Добавить одну каплю Тестового Реагента (красный колпачок) в Тестовую ячейку. Дозатор нужно держать вертикально при нанесении капель реагента. Вносить каплю реагента в центр ячейки и не дотрагиваться наконечником капельницы до проб крови и поверхности ячейки.

6.  Используя пластиковые палочки (содержащиеся в наборе) перемешать содержимое ячейки Отрицательного Контроля, а затем Тестовой ячейки приблизительно в течение 3-5 секунд, обеспечивая полное перемешивание и распространение реагента от центра до стенок ячейки. Палочки для перемешивания вторично не использовать.

7.  Включить секундомер.

8.  Слегка покачивая агглютинационную пластинку в течение двух минут, зафиксировать наличие агглютинации в каждой ячейке.

9.  Использованную агглютинационную пластинку повторно не применять.

Интерпретация результатов

Для правильной интерпретации результатов должна быть рассмотрена агглютинация в обеих ячейках.

1.  Результат является положительным, если тестовая ячейка характеризуется агглютинацией по сравнению с ячейкой Отрицательного Контроля. Если Отрицательный Контроль агглютинирует, то тест не действителен.

2.  Если Тестовый-результат отрицателен, добавить одну каплю Положительного Контроля (желтая крышка, колпачок) в тестовую ячейку и покачивать пластинку. Реакция видимой агглютинации должна появиться в течение 15 секунд. Отсутствие агглютинации делает тест не действительным. Определения не действительных результатов должны быть повторены.

3.  Положительный результат, указывающий на активный фибринолиз, должен быть получен с помощью РеД-Димер теста, когда содержание Д-димера соответствует или превышает предел отсечения, равный приблизительно 0,12 мг/л по результатам определения референсными количественными методами латексной агглютинации и ELISA.

Контроль качества

Отрицательный Контроль должен проводиться с каждым анализируемым образцом и должен использоваться как сравнительный показатель на отсутствие агглютинации. При агглютинации с Отрицательным Контролем результаты являются недействительными.

Положительный Контроль должен применяться для подтверждения достоверности отрицательного результата РеД-Димер теста. Неспособность Положительного Контроля вызвать агглютинацию является свидетельством потери активности реагентов набора.

Контрольные пробы также должны тестироваться в начале использования новых серий РеД-Димер теста и в любом случае получения спорных результатов.

Специфичность метода

Продукты деградации поперечносшитого фибрина Д-димера, Д-димера Е, и высокомолекулярных производных все распознаются моноклональными антителами в методе определения агглютинации цельной крови с помощью РеД-Димер теста. Не найдено связывания с продуктами деградации фибриногена, Х, Y, Д и Е или с фибриногеном в концентрациях до 1000 мг/л.

Ограничения метода

Клиническая диагностика не должна основываться только на результатах РеД-Димер теста. При постановке диагпоза должны быть включены клинические симптомы и другая значимая тестовая информация.

Нормальные значения гематокрита составляют 0,45±0,05 для мужчин и 0,41±0,05 (л/л) для женщин. Значения гематокрита вне пределов 0,40-0,50 (л/л) не оцениваются и могут влиять на проведение РеД-Димер теста.

Наличие действующих на холоду аутоантител (холодовые агглютинины) в пробах крови больных может вызвать агглютинацию собственных эритроцитов больного. В методе определения агглютинации цельной крови с помощью РеД-Димер теста это может вызвать агглютинацию Отрицательного Контроля, что делает результаты теста не действительными.

На определение Д-димера с помощью РеД-Димер теста не влияют следующие вещества в концентрациях:

Билирубин 0,2 мг/мл, белки (гамма глобулины) 50 мг/мл, липиды (триглицериды) 10 мг/мл.

Отмечена интерференция с ревматоидным фактором (в форме ложно-положительных результатов) при содержании, превышающем 200 МЕ/мл.

Меры предосторожности

·       Все компоненты данного набора предназначены только для диагностики in vitro.

·       Реагенты содержат консерванты. Избегать контакта с кожей и слизистыми оболочками. После контакта необходимо промыть участок кожи большим объемом воды.

·       Положительный контроль РеД-Димер содержит компоненты человеческого происхождения. Каждая индивидуальная доза крови, предназначенная для получения данного реагента, контролируется по HBsAg, антителам к вирусу гепатита С, ВИЧ-1 И ВИЧ-2 и используется только при получении отрицательных результатов контроля. Так как полное отсутствие инфекций никогда не может быть гарантировано, то компоненты набора следует рассматривать, как потенциально биологически опасные вещества, при работе с которыми необходимо соблюдать все меры предосторожности.

·       При работе с исследуемыми образцами следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, так как образцы плазмы крови человека следует рассматривать как потенциально инфицированные, способные длительное время сохранять и передавать вирусы иммунодефицита ВИЧ1 и ВИЧ2, гепатита В или любой другой возбудитель вирусной инфекции.

Набор Ред-Димер-тест производится совместно компаниями BBInternational (Великобритания) и НПО Ренам МБООИ «Общество больных гемофилией» (Россия).