Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител

Гелевая технология в микропробирках была предложена Y.Lapierre в 1989 г. Метод основан на агглютинации эритроцитов в агаровом геле «сефадекс», помещенном в микропробирки. Методика агглютинации в геле была разработана с целью стандартизации реакций гемагглютинации и получения достоверных результатов.

Гелевая технология предусматривает разделение эритроцитов при центрифугировании, при этом неагглютинированные эритроциты проходят через гель и оседают на дне пробирок (отрицательный результат), в то время как агглютинированные эритроциты задерживаются на поверхности или в толще геля (положительный результат).

Диапазон выполняемых тестов включает в себя определение фенотипа эритроцитов (включая слабые и вариантные антигены), антиглобулиновый тест, скрининг и идентификацию антител, тесты на совместимость и некоторые другие.

Забуференный декстрановый гель Sephadex G 100 superfine может быть как нейтральным, так и содержащим специфические антисыворотки или антиглобулиновый реагент на гелевом матриксе. На гель наносятся эритроциты или смесь эритроцитов и сыворотки. Клетки всегда вносятся перед сыворотками – в отличие от стандартных серологических методик – с тем, чтобы тестируемые сыворотки не контактировали с гелем, что особенно важно при проведении антиглобулинового теста.

Для проведения тестов обычно используются три вида геля:

Исследуемая кровь добавляется в верхнюю часть микропробирок диагностических карт, и при центрифугировании осуществляется разделение агглютинированных и неагглютинированных эритроцитов следующим образом: неагглютинированные эритроциты имеют размер, сравнимый с размером пор геля, и свободно проходят сквозь них под действием центробежной силы, формируя на дне микропробирки компактный осадок красного цвета - отрицательный результат; агглютинированные эритроциты ввиду больших размеров задерживаются на поверхности геля или в его толще – положительный результат. Фиксированная агглютинация в геле позволяет легко оценивать результат реакции, а наличие контрольной микропробирки в диагностической карте подтверждает достоверность полученных данных.

В зависимости от силы реакции агглютинации в гелевой среде принята следующая оценка полученных результатов:

- сильноположительный (++++) – образовавшиеся агглютинаты эритроцитов задержались на поверхности геля;

- положительный (+++) – агглютинаты располагаются в верхней трети столбика геля;

- слабоположительный (++) – агглютинаты фиксированы в верхних двух третях геля;

- очень слабоположительный (+) – агглютинаты располагаются в нижней трети геля;

- отрицательный (-) – эритроциты формируют на дне микропробирки компактный осадок (см. рис. 1).

Рис. 1. Степени реакции агглютинации в геле

ID-карты DiaMed предназначены для одновременного определения группы крови по системе АВО и резус-принадлежности эритроцитов доноров и реципиентов (включая их слабые варианты антигенов), а также для типирования других антигенов эритроцитов. При определении групп крови и резус-принадлежности применяют поликлональные или моноклональные реагенты. Наиболее частое применение на практике вследствие экономической целесообразности находят моноклональные сыворотки.

ID-карты	Конфигурация
DiaClon АВО/Rh for patients	A-B-AB-D(VI-)-CDE-ctl
DiaClon ABO/Rh for donors	A-B-AB-D(VI+)-CDE-ctl
DiaClon ABD-Confirmation for patients	A-B-D(VI-)/ A-B-D(VI-)
DiaClon ABD-Confirmation for donors	A-B-D(VI+)/ A-B-D(VI+)
DiaClon ABO/Rh for Newborns	A-B-AB-D(VI+)-ctl/AHG

Определение группы крови АВО и резус-принадлежности проводят путем идентификации специфических антигенов и антител (двойная или перекрестная реакция).

ID-карты	Конфигурация
ABO/D + Reverse Grouping	A-B-D-ctl/A1-B
DiaClon ABO/D Reverse Grouping (моно-)	A-B-D(VI-)-ctl/A1-B

Для углубленного обследования используют другие карты, например ID-карты для типирования системы Резус и Келл-принадлежности:

ID-карты	Конфигурация
DiaClon Rh subgroups + K	C-c-E-e-K(KeL1)-ctl
DiaClon Rh subgroups	c-E/c-E/c-E
DiaClon anti-K (KeL1)	6xK (KeL1)

Также имеются ID-карты для типирования других антигенов эритроцитов, в том числе и редко встречающихся.

(использование карт с моноклональными антителами)

1. Приготовить взвесь исследуемых эритроцитов в растворе для разведения 2, для чего:

- выдержать раствор для разведения 2 до достижения им комнатной темпертуры;

-промаркировать чистые пробирки;

-приготовить 5% суспензию исследуемых эритроцитов в растворе для разведения 2, поместив в пробирку 0,5 мл раствора для разведения 2 и 50 мкл исследуемой цельной крови или 25 мкл эритроцитной массы.

       2. Промаркировать ID-карту (№ исследуемого образца или ФИО пациента).

       3. Снять защитную фольгу с ID-карты.

       4. В каждую микропробирку ID-карты внести по 50 мкл приготовленной взвеси.

       5. Установить ID-карты в ротор ID-центрифуги (с обязательным уравновешиванием другими ID-картами, возможно неиспользованными).

       6. Центрифугировать ID-карты (время и режим центрифугирования постоянны и заданы автоматически).

       7. Оценить результат исследования. Результат в контрольной пробирке («ctl») должен быть всегда отрицательным. Положительная реакция в «контроле» может быть вызвана присутствием аутоантител и неспецифическими плазменными белками. Если «контроль» положителен – определение недостоверно, его необходимо повторить после однократного отмывания образца эритроцитов 0,9% раствором натрия хлорида или раствором для разведения 2.

       8. Результаты определения каждого антигена внести в соответствующую графу ID-карты (на белом поле внизу под каждым антигеном).

Исследуемые сыворотки и стандартные эритроциты для выявления антител добавляются в верхнюю часть микропробирок. После инкубации и центрифугирования агглютинированные эритроциты остаются в верхней части пробирки, так как не проходят через гель из-за большого размера агглютинатов (положительный результат). При отсутствии антител к антигенам тест-эритроцитов агглютинаты не образуются. Неагглютинированные эритроциты легко проходят через гель и оседают на дне пробирки (отрицательный результат). Характер агглютинации при выявлении антител к эритроцитам зависит от титра антител, их активности и оценивается от 4+ до +.

Скрининг антител выполняется как в нейтральном геле, так и в геле, содержащем антиглобулиновый реагент. В первом случае для исследования берутся обработанные ферментом эритроциты, во втором – суспензия эритроцитов в растворе низкой ионной силы. Скрининг и идентификация антител производятся с помощью стандартной панели эритроцитов. При оценке эффективности гелевого теста была установлена его более высокая чувствительность по сравнению с традиционными методиками.

ID-карты	Конфигурация
DiaScreen	4 AHG tests/2 enzyme tests
LISS Coombs + Enzyme test	3 AHG tests/3 enzyme tests
LISS/Coombs	6 AHG tests
Coombs Anti-IgG	6 AHG anti-IgG tests
NaCl, Enzyme test and cold agglutinins	6 enzyme tests (or 6 NaCl tests)

ID-карты	Конфигурация
LISS/Coombs	6 AHG tests
NaCl, Enzyme test and cold agglutinins	6 enzyme tests (or 6 NaCl tests)
Coombs Anti-IgG	6 AHG anti-IgG tests

Непрямой антиглобулиновый тест (НАТ) используется для выявления антиэритроцитарных антител. Постановка непрямого антиглобулинового теста в гелевом тесте не требует отмывания эритроцитов. НАТ используется для:

- определения в сыворотке реципиента антител к эритроцитам донора – при постановке пробы на совместимость;

- при скрининге «неожиданных» антиэритроцитарных антител;

- при исследовании антиэритроцитарных антител у беременных;

- при исследовании антител в сыворотке больных аутоиммунной гемолитической анемией.

- внести в три микропробирки ID-карты по 50 мкл стандартных (типированных) эритроцитов;

- добавить в микропробирки по 25 мкл исследуемой сыворотки;

- инкубировать в течение 15 мин. при температуре 37^о;

- центрифугировать ID-карты в течение 10 мин.;

- оценить результат исследования: положительный результат свидетельствует о наличии иммунных (алло-) антител в исследуемой сыворотке или плазме (для выяснения специфичности антител используют таблицу, прилагаемую к стандартным эритроцитам). Отрицательный результат свидетельствует об отсутствии иммунных антител в исследуемой сыворотке или плазме.

Обработка протеолитическими ферментами повышает агглютинабельность эритроцитов.

- внести в три микропробирки ID-карты по 50 мкл взвеси стандартных типированных эритроцитов, обработанных протеолитическим ферментом (ID-DiaCell I-II-III P);

- добавить в микропробирки по 25 мкл исследуемой сыворотки;

- инкубировать в течение 15 мин. при температуре 37^оС;

- центрифугировать ID-карты в течение 10 мин.;

- оценить результат исследования (см. антиглобулиновый тест).

- выдержать стандартные эритроциты и ID-карты в течение 30 мин. при температуре 2 – 8^оС;

- внести в три микропробирки по 50 мкл. стандартных эритроцитов;

- добавить по 25 мкл. исследуемой сыворотки;

- инкубировать в течение 30 мин. при температуре 2 – 8^оС;

- центрифугировать ID-карты в течение 10 мин.;

- оценить результат исследования: положительный результат свидетельствует о наличии холодовых антител в исследуемой сыворотке или плазме.

При наличии в исследуемой сыворотке холодовых или тепловых аутоантител могут наблюдаться ложноположительные результаты. Для исключения таких результатов необходимо поставить аутоконтроль:

- приготовить 0.8% взвесь эритроцитов исследуемой крови в растворе для разведения 2, добавив к 1 мл. раствора для разведения 2 10 мкл. цельной крови;

- внести по 50 мкл. приготовленной взвеси эритроцитов в микропробирку ID-карты для реакции Кумбса или для ферментного метода и холодовой агглютинации;

- в микропробирки ID-карты внести по 25 мкл. исследуемой сыворотки (для ферментного метода необходимо внести еще по 25 мкл. раствора для разведения 1);

- карты инкубировать 15 мин. при температуре 37^оС (для реакции Кумбса и ферментного метода) или при температуре 2–8^оС (для постановки аутоконтроля холодовой агглютинации).

Положительный результат в аутоконтроле свидетельствует о присутствии в исследуемой сыворотке аутоантител.

Целью пробы на индивидуальную совместимость является предотвращение трансфузий гемокомпонентов, несовместимых по антигенам эритроцитов. Тестирование сыворотки реципиента с эритроцитами предполагаемого донора – наиболее надежный способ выявления антител, способных вызвать повреждение перелитых эритроцитов, посттрансфузионные осложнения и осложнения гемолитического типа. Проведение этой пробы позволяет:

- подтвердить АВО-совместимость донора и реципиента;

- выявить антитела в сыворотке реципиента, направленные против антигенов эритроцитов донора.

Тестирование на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов не заменяет обязательное иммуногематологическое исследование (типирование антигенов эритроцитов по системам АВО, Резус, Келл, выявление антиэритроцитарных антител, поиск и идентификацию аллоантиэритроцитарных антител), а лишь дополняет его.

ID-карты	Конфигурация
Complete Crossmatch	A-B-D enz 2xAHG
DiaClon Complete Crossmatch	A-B-D(VI+) enz 2xAHG
LISS/Coombs	6 AHG tests
Coombs Anti-IgG	6 AHG anti-IgG tests
NaCl, Enzyme test and cold agglutinins	6 enz tests (or 6 NaCl tests)
ABD-Confirmation	ABD - ABD
DiaClon ABD-Confirmation for patients	A-B-D(VI-) A-B-D(VI-)

В связи с тем, что сенсибилизация может появиться даже после трансфузии индивидуально подобранных гемокомпонентов, для проведения проб на совместимость необходимо каждый раз использовать свежую сыворотку пациента, полученную после последней трансфузии компонентов крови.

Ход определения (с использованием ID-карт LISS/Coombs):

- приготовить рабочую суспензию, для чего в промаркированную пробирку внести 1 мл. раствора для разведения 2 и 12,5 мкл. эритроцитов донора;

- внести 50 мкл. рабочей суспензии в микропробирку диагностической карты LISS/Coombs;

- в эту же микропробирку добавить 25 мкл сыворотки или плазмы реципиента;

- инкубировать 15 мин. при температуре 37^оС;

- центрифугировать 10 мин.;

- оценить результат (положительная реакция свидетельствует о несовместимости крови донора и реципиента в результате присутствия в сыворотке крови реципиента антиэритроцитарных антител против антигенов эритроцитов донора).