Дылдин Д.Р. - директор ООО «Юнимед-Сервис»

Шибанов А.Н. - генеральный директор А/О Юнимед, член правления Ассоциации производителей средств клинической лабораторной диагностики, генеральный секретарь РАМЛД

 

Введение

В предыдущей статье мы обсуждали проблему выбора гематологического анализатора с точки зрения тех параметров и характеристик прибора, которые определяют эксплуатационные свойства анализатора и на которые следует обращать внимание, чтобы сделать правильный выбор. Комплекс описанных в статье параметров, можно сказать, определяет внешний образ прибора. В настоящей статье мы предлагаем заглянуть внутрь гематологического анализатора и посмотреть, как те или иные технические решения влияют на аналитические характеристики прибора, его эксплуатационные характеристики, на надежность и производительность. Такое углубленное понимание гематологического анализатора, очевидно, позволит специалистам клинико-диагностических лабораторий сделать свой выбор еще более компетентным.

 

Аналитический процесс

Современный гематологический анализатор является техническим устройством, которое обеспечивает выполнение аналитического процесса – определение клеточного состава крови человека в автоматическом режиме. На рисунке 1 представлена схема этого аналитического процесса. После ввода пробы крови в анализатор внутри прибора выполняются следующие процедуры: приготовление двух разведений введенной пробы крови: первое разведение - для подсчета концентрации лейкоцитов (в нем же после лизиса эритроцитов подсчитывается концентрация гемоглобина), и второе разведение – для подсчета концентрации эритроцитов и тромбоцитов.

 

Первое разведение крови получается путем дозирования цельной крови (обычно 10 – 20 мкл) и изотонического разбавителя (5 – 10 мл) с последующим добавлением лизирующего раствора, который разрушает эритроциты и преобразует все формы гемоглобина к одной форме.

  

Рисунок 1. Схема аналитического процесса подсчета гематологических показателей на современном геманализаторе.

 

Второе разведение крови получается путем дозирования первого разведения крови (обычно 50 – 100 мкл) (до того как в него добавляется лизирующий раствор) и изотонического разбавителя (5 – 10 мл).

 

На втором этапе анализатор определяет концентрации клеток крови в приготовленных разведениях, анализирует индивидуальные характеристики клеток крови: объем, свойства пропускания и рассеяния света; измеряет концентрацию производной формы гемоглобина. Для этого часть первого разведения крови по магистралям анализатора поступает в специальное устройство, которое подсчитывает лейкоциты, другая часть первого разведения поступает в проточную кювету гемоглобинометра, а второе разведение крови поступает в устройство, которое подсчитывает эритроциты и тромбоциты. Для расчета концентраций клеток при их подсчете измеряется объем разведения крови, прошедшего через устройство подсчета клеток.

 

На третьем этапе прибор выполняет комплекс вычислений, в результате которых получаются конечные данные анализа, и выводит на дисплей и на печать эти данные.

 

 

Техническая реализация элементов аналитического процесса

 

Ввод пробы крови в анализатор

 

В настоящее время в разных гематологических анализаторах реализованы четыре варианта ввода пробы крови:

 

Открытая пробирка с венозной или капиллярной кровью (стабилизированной ЭДТА), подносится к заборной игле прибора и поступает во внутренние магистрали прибора.

 

Герметично закрытая резиновой пробкой пробирка с кровью (стабилизированной ЭДТА), устанавливается в специальное устройство в анализаторе. Резиновая пробка автоматически прокалывается специальной иглой, через которую кровь поступает в магистрали анализатора. Этот ввод применяется в тех случаях, когда при взятии крови были использованы вакуумные пробирки, содержащие ЭДТА (вакутейнеры).

 

Данный способ применяется в тех случаях, когда первое разведение крови выполняется вне анализатора. Для этих целей в приборе имеется дополнительная заборная игла, к которой подносится разведенная кровь и через которую проба поступает в анализатор прямо в емкость для первого разведения крови.

 

4.      Ввод крови из микрокапилляра (Рис.2).

Этот метод применим в том случае, если забор капиллярной крови проводился с использованием специальных микрокапилляров объемом 20 мкл (прецизионные end-to-end капилляры). Микрокапилляр с кровью помещается в специальный адаптер, который затем вставляется в сециальный разъем гематологического анализатора.

В настоящее время разные фирмы выпускают гематологические анализаторы, в которых реализован только первый метод ввода крови (Адвия 60, Микрос 60, Культер АстДиф и др), первый и второй методы (Пентра 120), первый и третий методы (МЭК 6400), а также все четыре метода (Медоник серии СА620, Медоник серии М).

 

Следующий этап - дозирование цельной крови для приготовления первого разведения

 

Для выполнения этой операции в гематологическом анализаторе используется один из трех методов:

 

1. Шприцевой дозатор. Игла для ввода цельной крови (первый или второй способ ввода) подключена магистралью к шприцевому дозатору. При перемещении поршня дозатора на определенное расстояние, кровь в объеме 10 - 20 мкл, всасывается в иглу, после чего игла перемещается внутрь прибора и за счет движения поршня дозатора в обратном направлении кровь вытесняется из иглы в емкость для первого разведения.

Поворотный клапан (Рис. 3). Кровь через иглу ввода заполняет входную магистраль и канал поворотного клапан, который имеет точно заданный объем. Затем канал поворотного клапана, заполненный кровью, автоматически подключается к магистрали, по которой подается изотонический разбавитель.

Рисунок 3. Поворотный клапан.

 

3. Прецизионный микрокапилляр. Этот метод может применяться, если гематологический анализатор оснащен специальным адаптером для ввода крови из микрокапилляров (четвертый метод ввода пробы). После установки адаптера с микрокапилляром в анализатор по магистрали подается изотонический разбавитель точно заданного объема, который вымывает из капилляра кровь в емкость для первого разведения.

 

Наиболее точным и надежным методом дозирования цельной крови является второй – метод поворотного клапана. Коэффициент вариации объема дозирования менее 1%. При этом минимальный объем крови, который необходимо взять у пациента, составляет 55 – 150 мкл. Это связано с тем, что кровь должна заполнить магистраль перед каналом поворотного клапана (60 – 130 мкл) и сам канал поворотного клапана (20 мкл).

 

Метод прецизионного капилляра позволяет минимизировать объем взятия крови до 20 мкл, что актуально, например в педиатрии и неонатологии – кровь можно вводить в капилляр непосредственно из места прокола (палец, пяточка). Погрешность дозирования в этом случае определяется точностью изготовления микрокапилляров. Коэффициент вариации обычно не превышает 1,5%.

 

При использовании шприцевого дозатора в иглу забирается также малый объем крови (10 – 20 мкл). Однако, поскольку к игле анализатора кровь должна быть доставлена в пробирке, на практике минимальный объем крови составляет 100 - 200 мкл. Меньшее количество крови забирать нельзя, потому что кровь, как жидкость, обладающую высокой вязкостью после седиментации клеточных элементов, будет практически невозможно перемешать. В то же время следует отметить, что перемешивание крови перед проведением измерения на гематологическом анализаторе – обязательная процедура преаналитического этапа. Она необходима для обеспечения однородности пробы крови по клеточному составу во всем объеме исследуемого образца. Несоблюдение этого правила приводит к существенным искажениям измеряемых параметров! Обращаем также Ваше внимание на то, что шприцевой дозатор является наименее надежным элементов в анализаторе и требует достаточно частого (в зависимости от интенсивности эксплуатации) ремонта. Точность дозирования шприцевым дозатором неизбежно снижается вследствие износа уплотнительных элементов в процессе эксплуатации прибора.

 

Дозирование изотонического разбавителя и лизирующего раствора

 

В большинстве гематологических анализаторов (Микрос 60, Культер АстДиф, Адвия 60 и др.) эти процедуры осуществляются с помощью шприцевых дозаторов. Поскольку объемы дозирования довольно большие – несколько миллилитров, то проблемы обеспечения достаточной точности дозирования нет. Однако, как уже отмечалось выше, надежность шприцевых дозаторов невысока – из-за движения штока и коррозии под воздействием изотонического и лизирующего растворов детали дозатора изнашиваются и требуют периодической замены. В новых конструкциях гематологических анализаторов (Сисмекс КХ21, Медоник серии М) стали применять специальные устройства, представляющие собой стеклянную пипетку, оснащенную оптическими датчиками уровня жидкости. Отсутствие движущихся частей в этих устройствах значительно повышает их надежность.

 

Подсчет клеток крови, анализ их характеристик

 

Для выполнения этой процедуры в подавляющем числе типов гематологических анализаторов используется кондуктометрический метод. Этот метод основан на эффекте изменения электрического сопротивления микроотверстия (трансдьюсера) при прохождении через него клетки крови. Величина изменения сопротивления пропорциональна объему клетки. Это позволяет различать тромбоциты и эритроциты при их одновременном подсчете. Для подсчета лейкоцитов предварительно производится лизис эритроцитов. Устройство трансдьюсера во всех современных гематологических анализаторах практически одинаковое.

 

Концентрация клеток определяется как отношение числа подсчитанных клеток к объему разведения пробы, которое прошло через трасдьюсер. Для определения объема пробы, прошедшей через трансдьюсер при подсчете клеток используется один из двух методов:

 

1. Метод фиксированного времени. В этом методе по обе стороны трансдьюсера создается разность давлений точно заданной величины. При этом предполагается, что за определенное время через микроотверстие проходит точно известное количество пробы. Для чистого раствора это предположение абсолютно верно. Однако при измерении разведенной крови иногда возникают засоры микроотверстия, что приводит к ошибкам в определении концентрации клеток. Чаще всего это возникает при подсчете лейкоцитов. Кроме того, по мере износа вакуумного насоса в процессе эксплуатации, разность давлений по обе стороны трансдьюсера изменяется, что ведет к изменению количества измеряемой пробы. Этот метод реализован в анализаторах Адвия 60, Микрос ОТ8/18, Микрос 60, Сисмекс КХ-21, Культер АстДиф и др.

 

2. Метод измерительного цилиндра. В этом методе используется специальное устройство, которое позволяет точно фиксировать объем пробы, прошедшей через трансдьюсер. В данном случае небольшое изменение пропускной способности трансдьюсера из-за засорения микроотверстия не приводит к возникновению ошибки в определении концентарции, а приводит лишь к увеличению времени, в течение которого проводится измерение концентрации клеток.

 

При значительных засорениях измерительного отверстия происходит заметное увеличение времени счета. В этом случае прибор выдает сообщение о засорении трансдьюсора и измерение следует повторить после выполнения процедуры очистки трансдьюсора. Данный метод реализован в гематологических анализаторах серии Сисмекс К-1000, Диджиселл, СеллДин 900, Медоник.

 

Проблема засорения микроотверстия трансдьюсора присутствует во всех гематологических анализаторах. Поэтому инженеры постоянно совершенствуют технологию очистки микроотверстия. Один из наиболее часто применяемых методов – метод обратного потока. При засорении микроотверстия через него под достаточно большим давлением в обратном направлении пропускается поток изотонического разбавителя. Это приводит к вымыванию засорения из микроотверстия. Осадок белков и липидов на стенки микроотверстия не всегда отмывается потоком изотонического разбавителя. В этом случае необходимо применять специальный очищающий раствор, содержащий детергенты и протеолитические ферменты. В качестве очищающего раствора иногда применяют гипохлорид натрия.

 

Относительно недавно был изобретен принципиально новый метод очистки микроотверстия трансдьюсора. Этот метод основан на пропускании через микроотверстие электрического тока высокой частоты. При этом в объем отверстия выделяется большое количество энергии, температура жидкости превышает точку кипения и возникает микровзрыв, что приводит к механическому удалению со стенок трасдьюсора частиц и отложений. Данный метод впервые был применен в гематологических анализаторах Медоник серии СА530.

 

Кондуктометрический метод позволяет раздельно подсчитывать эритроциты, тромбоциты, лейкоциты. Измерение объема каждой прошедшей через трансдьюсор частицы позволяет получить гистограммы распределения клеток по объему, определить средний объем эритроцитов и тромбоцитов, рассчитать гематокрит и тромбокрит. При использовании специально подобранных лизирующего раствора и изотонического разбавителя можно несколько модифицировать различные субпопуляции лейкоцитов – лимфоциты уменьшаются в объеме практически до ядер, а гранулоциты напротив увеличивают свой объем. Пример такой гистограммы распределения лейкоцитов по объему показан на рис. 5. Подсчитывая раздельно лейкоциты в первой зоне (а), мы получаем концентрацию лимфоцитов, в третьей зоне (в) – гранулоциты. Средняя зона (б) – это зона средней фракции лейкоцитов. Таким образом, мы получаем трехкомпонентную лейкоцитарную формулу.

  

Рис. 5. Трехкомпонентная гистограмма распределения лейкоцитов по объему.

 

В заключение хотелось бы еще раз подчеркнуть, что выбор модели гематологического анализатора для каждой лаборатории - очень ответственная задача. Для ее оптимального решения необходим внимательный анализ большого количества характеристик. В данной и предыдущей статьях ("Выбираем гематологический анализатор (часть 1)"), основываясь на большом собственном опыте оснащения лабораторий современным оборудованием, мы попытались изложить основные особенности устройства гематологических анализаторов, которые существенно влияют на их эксплуатационные характеристики и техническую надежность. Надеемся, что это поможет специалистам КДЛ в решении задачи правильного выбора прибора.